硬纤维瘤，又称侵袭性纤维瘤病，是一种局部具有侵袭性的肿瘤，尽管不会转移，但其复发率较高，严重影响患者的生活质量。目前，关于硬纤维瘤的分子机制研究尚不充分，这限制了患者的治疗选择。本文旨在开发新的硬纤维瘤预后标志物，并验证先前发表的相关标志物，同时深入研究硬纤维瘤在基因组、表观基因组及转录组水平的分子异质性，为精准治疗提供理论依据。

在研究方法上，我们对20例原发性硬纤维瘤的31个标本进行了RNA-seq分析，发现有14个基因在复发和未复发患者之间表现出差异表达。然而，这些基因在同一患者及同一肿瘤的不同区域的表达却具有高度变异性。此外，我们验证了两项先前研究中的预后基因表达特征，发现不同患者及同一肿瘤内这些基因的表达差异显著。例如，在Salas研究中报道的36个基因特征中，仅FECH基因在复发与未复发肿瘤中表现出显著差异，这与原研究结果相反；而Kohsaka研究中的IFI6和LGMN基因在本研究中未显示出与复发相关的表达差异，且在同一肿瘤内的表达也呈现异质性。

通过IHC分析，我们在蛋白水平验证了这些标志物的可变表达，且与局部复发没有明显相关性，从而进一步强调了基因表达特征的预后分类受到肿瘤取样区域的影响。

对于患者1，我们发现原发性和复发性肿瘤均携带CTNNB1基因的T41A突变，而复发性肿瘤的两个区域还出现了S45P突变，且两者的VAF不同。系统发育分析揭示，原发性肿瘤存在三个不同的亚克隆，复发性肿瘤则有两个新亚克隆，并且复发性肿瘤共享了PTP4A1基因突变，其RNA表达水平低于原发性肿瘤的野生型区域。尽管原发性和复发性肿瘤的DNA拷贝数变化较小，但DNA甲基化与转录组谱则显示出明显差异，例如原发性肿瘤的某一区域富集了与线粒体氧化磷酸化相关的基因，部分基因表达与甲基化呈负相关。

在患者2的分析中，原发性和复发性肿瘤同样携带CTNNB1T41A突变，在第三次复发的肿瘤中则出现了三个新的DNA突变（MKI67、MYOF和HAUS1），其中MYOF变异在RNA-seq中得到了确认。原发性和复发性肿瘤表现出了多个克隆和亚克隆的DNA拷贝数变化，DNA甲基化谱也形成了不同的聚类，转录组分析则显示原发性肿瘤与第二、第三次复发肿瘤之间的转录组谱高度不同，但第二次复发肿瘤的某一区域与原发性肿瘤相似。

患者3的观察结果显示，其原发性及大多数复发性肿瘤均携带CTNNB1S45F突变，仅第二次复发中一个样本未检出此突变，但RNA-seq证实了其存在。第一次与第二次复发的某一区域存在大量局灶性DNA拷贝数改变，第二次复发肿瘤的表观基因组谱亦与其他标本有显著不同，而原发性肿瘤与第一次复发肿瘤在转录组层面表现出高度的肿瘤内异质性，第三次复发肿瘤则富集了12个有关缺氧的基因。

综上所述，这项研究首次全面揭示了硬纤维瘤在基因组、表观基因组及转录组层面的高度肿瘤内与肿瘤间异质性，表明基于单肿瘤活检的分子分析可能会低估硬纤维瘤的分子变化程度，同时也强调了预后转录组特征易受取样偏差的影响。复发性硬纤维瘤展现出了原发性肿瘤中不存在的多种分子变化，这指示肿瘤在发展过程中经历了分子进化，具有重要的药物研发和生物标志物验证的意义。

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